Proteinase K mNGS (cair)
Proteinase K adalah protease serin stabil dengan spesifisitas substrat yang luas.Ini mendegradasi banyak protein dalam keadaan aslinya bahkan dengan adanya deterjen.Bukti dari studi struktur kristal dan molekul menunjukkan bahwa enzim tersebut termasuk dalam keluarga subtilisin dengan triad katalitik situs aktif (Asp39-Miliknya69-Ser224).Tempat pembelahan yang dominan adalah ikatan peptida yang berdekatan dengan gugus karboksil asam amino alifatik dan aromatik dengan gugus alfa amino yang diblokir.Ini biasanya digunakan karena spesifisitasnya yang luas.Proteinase K ini dirancang khusus untuk mNGS.Dibandingkan dengan proteinase K lainnya, protein ini mengandung lebih sedikit kontaminasi asam nukleat dengan kinerja enzimatik yang sama, yang dapat menjamin penerapan mNGS hilir dengan lebih baik.
Kondisi penyimpanan
2-8℃ selama 2 tahun
Spesifikasi
| Penampilan | Cairan tidak berwarna sampai coklat muda |
| Aktivitas | ≥800 U/ml |
| Konsentrasi Protein | ≥20mg/ml |
| Nickase | Tidak ada yang terdeteksi |
| DNase | Tidak ada yang terdeteksi |
| RNase | Tidak ada yang terdeteksi |
Properti
| nomor EC | 3.4.21.64(Rekombinan dari album Tritirachium) |
| Titik isoelektrik | 7.81 |
| pH optimal | 7.0- 12.0 Gambar 1 |
| Suhu optimal | 65 ℃ Gambar 2 |
| stabilitas pH | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 jam) Gambar 3 |
| Stabilitas termal | Di bawah 50 ℃ (pH 8,0, 30 menit) Gambar 4 |
| Stabilitas penyimpanan | Lebih dari 90% aktivitas selama 12 bulan pada 25 ℃ |
| Aktivator | SDS, urea |
| Inhibitor | Diisopropil fluorofosfat;fenilmetilsulfonil fluorida |
Aplikasi
1. Kit diagnostik genetik
2. Kit ekstraksi RNA dan DNA
3. Ekstraksi komponen non-protein dari jaringan, degradasi pengotor protein, seperti DNAvaksin dan persiapan heparin
4. Persiapan DNA kromosom dengan elektroforesis berdenyut
5. Noda Barat
6. Diagnosis in vitro dengan reagen albumin glikosilasi enzimatik
Tindakan pencegahan
Kenakan sarung tangan dan kacamata pelindung saat menggunakan atau menimbang, dan jaga ventilasi yang baik setelah digunakan.Produk ini dapat menyebabkan reaksi alergi kulit dan iritasi mata yang serius.Jika terhirup, dapat menyebabkan gejala alergi atau asma atau sesak napas.Dapat menyebabkan iritasi pernafasan.
Definisi satuan
Satu unit (U) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghidrolisis kasein untuk menghasilkan 1 moltirosin per menit dalam kondisi berikut.
Persiapan reagen
Reagen I: 1g kasein susu dilarutkan dalam 50ml larutan natrium fosfat 0,1M (pH 8,0), diinkubasi dalam air 65-70 ℃ selama 15 menit, diaduk dan dilarutkan, didinginkan dengan air, diatur dengan natrium hidroksida hingga pH 8,0, dan volume tetap 100ml.
Reagen II: asam trikloroasetat 0,1M, natrium asetat 0,2M, asam asetat 0,3M.
Reagen III : 0,4M Na2CO3larutan.
Reagen IV: Reagen forint diencerkan dengan air murni sebanyak 5 kali.
Reagen V: Pengencer enzim: larutan natrium fosfat 0,1M (pH 8,0).
Reagen VI : larutan tirosin : 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirosin dilarutkan dengan 0,2M HCl.
Prosedur
1. 0,5ml reagen I dihangatkan terlebih dahulu hingga 37℃, tambahkan 0,5ml larutan enzim, aduk rata, dan inkubasi pada suhu37℃ selama 10 menit.
2. Tambahkan 1ml reagen II untuk menghentikan reaksi, aduk rata, dan lanjutkan inkubasi selama 30 menit.
3. Larutan reaksi sentrifugasi.
4. Ambil 0,5ml supernatan, tambahkan 2,5ml reagen III, 0,5ml reagen IV, aduk rata dan inkubasi pada suhu 37℃selama 30 menit.
5. OD660ditentukan sebagai OD1;kelompok kontrol kosong: 0,5ml reagen V digunakan untuk menggantikan enzimsolusi untuk menentukan OD660sebagai OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Kurva standar L-tirosin: 0,5mL larutan L-tirosin dengan konsentrasi berbeda, 2,5mL Reagen III, 0,5mL Reagen IV dalam tabung sentrifugasi 5mL, inkubasi dalam suhu 37℃ selama 30 menit, deteksi OD660untuk konsentrasi L-tirosin yang berbeda, maka diperoleh kurva standar Y=kX+b, dimana Y adalah konsentrasi L-tirosin, X adalah OD600.
Perhitungan
2: Total volume larutan reaksi (mL)
0,5: Volume larutan enzim (mL)
0,5: Volume cairan reaksi yang digunakan dalam penentuan kromogenik (mL)
10: Waktu reaksi (menit)
Df: Pengenceran berganda
C: Konsentrasi enzim (mg/mL)
Referensi
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biokimia.Biofisika.Res.Komunitas.(1971);44:513.
3.Hilz, H.dkk.,euro.J. Biokimia.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet Al., Kloning Molekuler: Manual Laboratorium, edisi ke-2, Cold Spring HarborPers Laboratorium, Cold Spring Harbor (1989).
Angka
Ara.1 Optimal pH
Larutan penyangga 100mM:pH6.0-8.0, Na-fosfat;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Konsentrasi enzim: 1mg/mL
Gambar.2 Suhu optimal
Reaksi dalam 20 mM buffer K-fosfat pH 8,0.Konsentrasi enzim: 1 mg/mL
Gambar.3 pH Stabilitas
25 ℃, 16 jam perawatan dengan larutan buffer 50 mM: pH 4,5- 5,5, Asetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0- 12,5, Glisin-NaOH.Konsentrasi enzim: 1 mg/mL
Gambar.4 Termal stabilitas
Perawatan 30 menit dengan buffer Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.Konsentrasi enzim: 1 mg/mL
Gambar.5 Penyimpanan stability at 25℃
