Proteinase K (bubuk terliofilisasi)
Nomor Kucing: HC4500A
Proteinase K adalah protease serin stabil dengan spesifisitas substrat yang luas.Ini mendegradasi banyak protein dalam keadaan aslinya bahkan dengan adanya deterjen.Bukti dari studi struktur kristal dan molekul menunjukkan bahwa enzim tersebut termasuk dalam keluarga subtilisin dengan triad katalitik situs aktif (Asp39-Miliknya69- Ser224).Tempat pembelahan yang dominan adalah ikatan peptida yang berdekatan dengan gugus karboksil asam amino alifatik dan aromatik dengan gugus alfa amino yang diblokir.Biasanya digunakan karena luasnyakekhususan.
Kondisi penyimpanan
2-8℃ penyimpanan jangka pendek, -25~-15℃ penyimpanan jangka panjang.Status bubuk kering -25~-15℃ berlaku selama 3 tahun;bubuk enzim harus dilarutkan ke dalam volume yang sesuai.
Spesifikasi
| Penampilan | Bubuk lyophilized amorf berwarna putih sampai putih pucat |
| Aktivitas | ≥30 U/mg |
| DNase | Tidak ada yang terdeteksi |
| RNase | Tidak ada yang terdeteksi |
Properti
| nomor EC | 3.4.21.64 (Rekombinan dari album Tritirachium) |
| Berat molekul | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Titik isoelektrik | 7.81 |
| pH optimal | 7.0-12.0 Gambar 1 |
| Suhu optimal | 65 ℃ Gambar.2 |
| stabilitas pH | pH 4,5-12,5 (25℃, 16 jam) Gambar.3 |
| Stabilitas termal | Di bawah 50℃(pH 8,0, 30 menit) Gbr.4 |
| Aktivator | SDS, urea |
| Inhibitor | Diisopropil fluorofosfat;fenilmetilsulfonil fluorida |
Aplikasi
1. Kit diagnostik genetik
2. Kit ekstraksi RNA dan DNA
3. Ekstraksi komponen non-protein dari jaringan, degradasi pengotor protein, seperti vaksin DNA dan pembuatan heparin
4. Persiapan DNA kromosom dengan elektroforesis berdenyut
5. Noda Barat
6. Diagnosis in vitro dengan reagen albumin glikosilasi enzimatik
Tindakan pencegahan
Kenakan sarung tangan dan kacamata pelindung saat menggunakan atau menimbang, dan jaga ventilasi yang baik setelah digunakan.Produk ini dapat menyebabkan reaksi alergi kulit dan iritasi mata yang serius.Jika terhirup, dapat menyebabkan gejala alergi atau asma atau sesak napas.Dapat menyebabkan iritasi pernafasan.
Pengujian kadar logam
Definisi satuan
Satu unit (U) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghidrolisis kasein untuk menghasilkan 1 mol tirosin per menit dalam kondisi berikut.
Persiapan reagen
Reagen I: 1g kasein susu dilarutkan dalam 50ml larutan natrium fosfat 0,1M (pH 8,0), diinkubasi dalam air 65-70 ℃ selama 15 menit, diaduk dan dilarutkan, didinginkan dengan air, diatur dengan natrium hidroksida hingga pH 8,0, dan volume tetap 100ml.
Reagen II: asam trikloroasetat 0,1M, natrium asetat 0,2M, asam asetat 0,3M.
Reagen III : 0,4M Na2CO3larutan.
Reagen IV: Reagen forint diencerkan dengan air murni sebanyak 5 kali.
Reagen V: pengencer enzim: larutan natrium fosfat 0,1M (pH 8,0).
Reagen VI: larutan tirosin: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirosin dilarutkan dengan HCL 0,2M.
Prosedur
1. 0,5ml reagen I dihangatkan terlebih dahulu hingga 37℃, tambahkan 0,5ml larutan enzim, aduk rata, dan inkubasi pada suhu 37℃ selama 10 menit.
2. Tambahkan 1 ml reagen II untuk menghentikan reaksi, aduk rata, dan lanjutkan inkubasi selama 30 menit.
3. Larutan reaksi sentrifugasi.
4. Ambil 0,5ml supernatan, tambahkan 2,5ml reagen III, 0,5ml reagen IV, aduk rata dan inkubasi pada suhu 37℃ selama 30 menit.
5. OD660ditentukan sebagai OD1;kelompok kontrol kosong: 0,5ml reagen V digunakan untuk menggantikan larutan enzim untuk menentukan OD660sebagai OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Kurva standar L-tirosin: 0,5mL larutan L tirosin dengan konsentrasi berbeda, 2,5mL Reagen III, 0,5mL Reagen IV dalam tabung sentrifugasi 5mL, inkubasi dalam suhu 37℃ selama 30 menit, deteksi OD660untuk konsentrasi L-tirosin yang berbeda, maka diperoleh kurva baku Y=kX+b, dimana Y adalah konsentrasi L-tirosin, X adalah OD600.
Perhitungan
2: Total volume larutan reaksi (mL)
0,5: Volume larutan enzim (mL)
0,5: Volume cairan reaksi yang digunakan dalam penentuan kromogenik (mL)
10: Waktu reaksi (menit)
Df: Pengenceran berganda
C: Konsentrasi enzim (mg/mL)
Referensi
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biokimia.Biofisika.Res.Komunitas.(1971);44:513.
3.Hilz, H.dkk.,euro.J. Biokimia.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet Al., Kloning Molekuler: Manual Laboratorium, edisi ke-2, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Gambar 2 Suhu optimal
Reaksi dalam 20 mM buffer K-fosfat pH 8,0.Konsentrasi enzim: 1mg/mL
Gambar 3 pH Stabilitas
25℃, 16 jam perawatan dengan larutan buffer 50mM: pH 4,5-5,5, Asetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCL.pH 9,0-12,5, Glisin-NaOH.Konsentrasi enzim: 1mg/mL
Gambar 4 Termal stabilitas
Perawatan 30 menit dengan buffer Tris-HCL 50mM, pH 8,0.Konsentrasi enzim: 1mg/mL
Gambar 5 Penyimpanan stability at 25℃
