Kit PCR langsung tanam

Nomor Kucing: HCR2020A

Kit PCR Tanaman Langsung cocok untuk amplifikasi langsung daun tanaman, biji, dll., dan dapat digunakan untuk penyaringan sampel tanaman dengan throughput tinggi yang tidak mengandung polisakarida dan polifenol.Amplifikasi langsung DNA polimerase berdasarkan evolusi terarah memiliki toleransi yang lebih baik dibandingkan inhibitor PCR pada tanaman.Sementara itu, ia mempertahankan kinerja amplifikasi yang tinggi, yang cocok untuk amplifikasi fragmen DNA dalam jarak 5 kb.Buffer Lisis A yang unik dalam kit dapat digunakan untuk melisiskan jaringan tanaman segar atau beku.Mudah dioperasikan dan lisat dapat digunakan sebagai templat amplifikasi tanpa pemurnian.Sistem ini mengandung bahan pelindung yang memungkinkan sampel mentah diamplifikasi secara efektif setelah pembekuan dan pencairan berulang kali.2 × Campuran Master Langsung Pabrik hanya perlu menambahkan primer dan templat untuk melakukan reaksi amplifikasi, sehingga mengurangi operasi pemipetan dan meningkatkan hasil deteksi serta reproduktifitas hasil.

Komponen

*Plant Direct Lysis Buffer B adalah reagen opsional yang digunakan untuk menetralkan Plant Direct Lysis Buffer A untuk memperpanjang waktu penyimpanan sampel.Hal ini dapat digunakan sesuai dengan situasi sebenarnya.

Kondisi penyimpanan

2 × Campuran Induk Tanaman Langsung, simpan pada -30 ~ -15℃ dan hindari pembekuan dan pencairan berulang kali;Plant Direct Lysis Buffer, simpan pada -30 ~ -15℃ atau 2 ~ 8℃.

Proses Percobaan

Pemrosesan Sampel–Daun Tanaman

Metode langsung:Disarankan menggunakan daun muda.Gunakan pelubang kertas dengan diameter tetap 0,5 – 3 mm untuk mendapatkan sampel yang kecil dan seragam, lalu langsung tambahkan sampel ke sistem PCR (disarankan sistem 50 μl).Catatan, pastikan sampel berada dalam larutan PCR dan tidak menempel pada dinding tabung.Jika PCR langsung digunakan untuk memperkuat fragmen panjang dan sampel kompleks, menggunakan sampel dengan diameter lebih kecil (0,5 – 1 mm) sebagai templat dapat membantu mendapatkan hasil yang lebih baik.

Metode penggilingan lisis:Disarankan menggunakan daun muda.Ambil sepotong kecil daun (diameter sekitar 1 – 3 mm), masukkan ke dalam 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, dan giling sebanyak mungkin (langkah ini dapat dilakukan dengan meremas daun menggunakan ujung pipet 100 μl untuk menumbuk sampel).Jika volume jaringan daun yang digunakan lebih besar (tidak melebihi 7 mm), tingkatkan volume buffer pengenceran hingga 50 μl.Setelah daun digiling, larutan akan tampak berwarna hijau.Setelah sentrifugasi singkat, tambahkan 1 μl supernatan ke sistem PCR sebagai templat reaksi.

Metode lisis termal:Disarankan menggunakan daun muda.Ambil sepotong kecil daun (berdiameter sekitar 1 – 3 mm), masukkan ke dalam 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, dan panaskan pada suhu 95°C selama 5 – 10 menit.Waktu lisis dapat diperpanjang secara tepat untuk daun yang sulit lisis (tidak lebih dari 20 menit).Jika volume jaringan daun yang digunakan lebih besar (tidak melebihi 7 mm), tingkatkan volume buffer pengenceran hingga 50 μl.Setelah pemanasan, sentrifugasi sebentar, dan tambahkan 1 μl supernatan ke dalam sistem PCR sebagai template reaksib.

Pemrosesan Sampel–Benih Tanaman

Metode penggilingan lisis:Gunakan pisau bedah untuk memotong biji dengan diameter 5 mm, tambahkan ke dalam 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, dan giling sampel dengan ujung pipet atau alat lainnya.Vortex sebentar dan diamkan pada suhu kamar selama 3 – 5 menit.Pastikan sampel benih terendam dalam buffer pengenceran.Setelah sentrifugasi singkat, tambahkan 1 μl supernatan ke sistem PCR sebagai templat reaksi.

Metode lisis termal:Gunakan pisau bedah untuk memotong biji dengan diameter 5 mm, tambahkan ke dalam 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, dan panaskan pada suhu 95°C selama 5 – 10 menit.Waktu lisis dapat diperpanjang secara tepat untuk daun yang sulit lisis (tidak lebih dari 30 menit).Setelah pemanasan, sentrifugasi sebentar, dan tambahkan 1 μl supernatan ke dalam sistem PCR sebagai template reaksib.

A.Gunting atau alat lain juga dapat digunakan untuk memotong sampel dengan ukuran yang sesuai;jika pelubang atau gunting digunakan kembali, harus dibersihkan dengan larutan natrium hipoklorit 2% sebelum digunakan untuk mencegah kontaminasi silang antar sampel.

B.Pastikan Plant Direct Lysis Buffer benar-benar meleleh sebelum digunakan.Jika buffer kental atau memiliki endapan, buffer dapat dipanaskan pada suhu 37℃ hingga meleleh sepenuhnya sebelum digunakan.

C.Volume templat dalam sistem reaksi dapat diatur secara tepat sesuai dengan perbedaan volume bahan tanaman dan pengencer yang ditambahkan.

Penyangga Lisis Tanaman Langsung

Buffer Lisis Langsung Tanaman A yang terkandung dalam produk ini telah dioptimalkan secara ketat untuk melepaskan genom sebagian besar jaringan tanaman dan cocok untuk penyimpanan jangka pendek tanaman mentah pada suhu 4℃.Jika sampel perlu disimpan untuk jangka waktu yang lebih lama (misalnya 1 – 2 bulan), disarankan untuk memindahkan supernatan ke tabung EP baru dan menyimpannya pada suhu -20℃.Untuk menyimpan sampel dengan lebih stabil, tambahkan Plant Direct Lysis Buffer B dengan volume yang sama ke supernatan yang ditransfer, aduk rata dan simpan pada suhu -20℃.Waktu penyimpanan yang stabil bervariasi menurut sampel tanaman dan negara bagian.

Sistem Reaksi

A.Ini mengandung Mg²⁺pada konsentrasi akhir 2 mM.

B.Disarankan untuk menggunakan konsentrasi akhir 0,4μM untuk setiap primer.Penggunaan primer yang berlebihan akan menyebabkan peningkatan amplifikasi nonspesifik.

C.Jumlah sampel yang digunakan dapat disesuaikan dengan keadaan sebenarnya.Jumlah yang digunakan dalam satu reaksi sampel mentah yang dilisiskan dapat disesuaikan antara 2% – 20% dari total volume reaksi.Menggunakan terlalu banyak sampel dapat menyebabkan kegagalan amplifikasi.

Program Reaksi

A.Denaturasi Awal (98℃, 5 menit) mendorong lisis jaringan tanaman, melepaskan DNA genom yang dapat digunakan untuk amplifikasi PCR.Jangan mempersingkat waktu atau menurunkan suhu.

B.Disarankan untuk mengaturnya sama dengan nilai Tm primer atau 2 ~ 4℃ lebih tinggi dari nilai Tm.DNA polimerase amplifikasi langsung yang digunakan dalam produk ini berbeda dari DNA polimerase Taq konvensional, dan memiliki persyaratan khusus untuk suhu anil reaksi; penggunaan suhu anil tinggi dapat secara efektif mengurangi amplifikasi nonspesifik dan meningkatkan efisiensi amplifikasi.Untuk templat yang kompleks, amplifikasi yang efisien dapat dicapai dengan menyesuaikan suhu anil dan memperpanjang waktu ekstensi.

C.Jika panjang produk amplifikasi ≤1 kb, waktu perpanjangan diatur pada 30 detik/kb;jika panjang produk amplifikasi >1 kb, waktu perpanjangan diatur pada 60 detik/kb.

D.Untuk sampel kompleks atau sampel dengan hasil amplifikasi rendah, jumlah siklus dapat ditingkatkan menjadi 40 -50 siklus.

Aplikasi

Hal ini berlaku untuk amplifikasi langsung jaringan tanaman dan penyaringan sampel tanaman dengan throughput tinggi yang tidak mengandung polisakarida dan polifenol.

Catatan

Untuk penggunaan penelitian saja.Tidak untuk digunakan dalam prosedur diagnostik.

1. Untuk amplifikasi tanaman mentah atau amplifikasi langsung, disarankan untuk menggunakan DNA genom murni sebagai kontrol positif sebelum memulai percobaan untuk memastikan bahwa sistem, primer, dan pengoperasian sudah benar.

2. DNA polimerase amplifikasi langsung yang digunakan dalam kit ini memiliki aktivitas proofreading yang kuat.Jika kloning TA perlu dilakukan, disarankan untuk memurnikan DNA sebelum menambahkan adenin.

3. Panduan Desain Primer：

A.Direkomendasikan bahwa alas terakhir pada ujung 3′ primer adalah G atau C.

B.Ketidakcocokan berturut-turut harus dihindari pada 8 basa terakhir pada ujung 3′ primer.C.Hindari struktur jepit rambut di ujung 3′ primer.

D.Perbedaan nilai Tm primer maju dan primer terbalik tidak boleh lebih dari 1℃ dan nilai Tm harus disesuaikan hingga 60 ~ 72℃ (Primer Premier 5 disarankan untuk menghitung nilai Tm).

e.Urutan primer tambahan tambahan yang tidak sesuai dengan template, sebaiknya tidak dimasukkan saat menghitung nilai Tm primer.

F.Direkomendasikan kandungan GC pada primer adalah 40%-60%.

G.Distribusi keseluruhan A, G, C dan T dalam primer harus serata mungkin.Hindari menggunakan wilayah dengan konten GC atau AT tinggi.

H.Hindari adanya rangkaian komplementer dari 5 basa atau lebih baik di dalam primer atau di antara dua primer dan hindari adanya rangkaian komplementer dari 3 basa atau lebih pada ujung 3′ dari dua primer.

Saya.Gunakan fungsi NCBI BLAST untuk memeriksa spesifisitas primer untuk mencegah amplifikasi nonspesifik.