Glikosilase DNA Urasil
Uracil-DNA Glycosylase (UNG atau UDG) merupakan klon rekombinan E.coli dengan berat molekul 25 kDa.Ini mengkatalisis pelepasan urasil bebas dari DNA untai tunggal dan ganda yang mengandung urasil, dan tidak aktif terhadap RNA, dan dapat digunakan untuk mencegah kontaminasi produk amplifikasi PCR.Prinsip kerjanya didasarkan pada kenyataan bahwa jika dUTP digantikan dengan dTTP dalam reaksi PCR dan produk amplifikasi PCR yang mengandung basa dU terbentuk, enzim dapat secara selektif memutus ikatan glikosidik basa U dalam untai tunggal dan untai ganda. DNA dan mendegradasi produk amplifikasi PCR.
Aplikasi yang Direkomendasikan
Amplifikasi Pencegahan Kontaminasi
Kondisi penyimpanan
-20°C untuk penyimpanan jangka panjang, harus dicampur dengan baik sebelum digunakan, hindari sering dibekukan-dicairkan.
Penyangga penyimpanan
20 mM Tris-HCl (pH 8,0) , 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Penstabil, 50% Gliserol.
Definisi Satuan
Banyaknya enzim yang diperlukan untuk mendegradasi 1µg DNA untai tunggal yang mengandung basa dU dalam 1 jam pada suhu 37°C adalah 1 unit.
Kontrol kualitas
1.Kemurnian elektroforesis SDS-PAGE lebih besar dari 98%
2.Sensitivitas amplifikasi, kontrol batch-ke-batch, stabilitas
3.Setelah 1U UNG diperlakukan pada suhu 50℃ selama 2 menit, templat yang berisi U di bawah 103 salinan harus terdegradasi sepenuhnya dan tidak ada produk amplifikasi yang dapat dihasilkan.
4.Tidak ada aktivitas nuklease eksogen
instruksi
| Komponen | Volume (µL) | Konsentrasi akhir |
| 10 × Buffer PCR (bebas dNTP, Mg²+bebas) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ganti dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl22 | 2-8 μL | 1-4mm |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 kamu |
| 5 U/µL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Campuran PrimerA | 2 | 1× |
| Templat | - | ＜1μg/reaksi |
| ddH₂O | Sampai 50 | - |
Catatan: a: Jika digunakan untuk qPCR/qRT-PCR, probe fluoresen harus ditambahkan ke dalam sistem reaksi.Biasanya konsentrasi primer akhir sebesar 0,2 μM dapat memberikan hasil yang baik;ketika kinerja reaksi buruk, konsentrasi primer dapat disesuaikan dalam kisaran 0,2-1 μM.Biasanya, konsentrasi probe dioptimalkan pada kisaran 0,1-0,3 μM.Eksperimen gradien konsentrasi dapat dilakukan untuk menemukan kombinasi primer dan probe terbaik.
Catatan
1.Enzim UNG dapat digunakan untuk menghilangkan produk amplifikasi dUTP yang terkontaminasi dari sistem reaksi sebelum reaksi amplifikasi PCR, kemudian untuk menghindari hasil positif palsu akibat kontaminasi produk.
2.Suhu optimal untuk penggunaan enzim UNG dalam reaksi PCR anti kontaminasi umumnya 50℃ selama 2 menit;kondisi inaktivasi adalah 95℃ selama 5 menit.
3.Hindari seringnya pembekuan-pencairan, dan jangan sampai terkena fluktuasi suhu yang besar.
4.Gen yang berbeda yang akan diamplifikasi memiliki efisiensi pemanfaatan dUTP dan sensitivitas terhadap enzim UNG yang berbeda, oleh karena itu, jika penggunaan sistem UNG menyebabkan penurunan sensitivitas deteksi, sistem reaksi harus disesuaikan dan dioptimalkan, jika Anda memerlukan dukungan teknis, silakan hubungi perusahaan kita.
