Kit Maxi Plasmid EndoFree

Kondisi penyimpanan

RNaseA harus disimpan pada -30 ~ -15℃ dan diangkut pada ≤0℃ .

Pemulung Endotoksin dapat disimpan pada suhu 2 ~ 8℃ selama satu bulan, disimpan pada suhu -30 ~ -15℃ untuk penyimpanan jangka panjangdan diangkut pada ≤0℃.

Komponen lainnya harus disimpan pada suhu kamar (15 ~25℃) dan diangkut pada suhu kamar.

Komponen

RNAseA:10 mg/ml, digunakan untuk menghilangkan RNA.

Penyangga P1:buffer suspensi bakteri, tambahkan RNaseA ke Buffer P1 sebelum digunakan pertama kali.

Penyangga P2:buffer lisis bakteri (mengandung SDS/NaOH).

Penyangga P4:buffer penetral.

Pemulung Endotoksin:efektif menghilangkan endotoksin dari ekstrak plasmid kasar.

Penyangga PW:cuci buffer, tambahkan volume etanol yang ditentukan sebelum digunakan pertama kali.

Penyangga TBC:penyangga elusi.

Kolom Maxi DNA FastPure:kolom adsorpsi DNA plasmid.

Tabung Pengumpul 50 ml:tabung pengumpul filtrat.

Tabung Pengumpul Bebas Endotoksin:tabung pengumpul DNA plasmid.

Bahan yang Disiapkan

Etanol absolut, isopropanol, tabung centrifuge alas bulat 50 ml dan 50 ml bebas endotoksintabung sentrifugasi.

Aplikasi

Produk ini cocok untuk ekstraksi plasmid skala besar dari 150 - 300 ml larutan bakteridibudidayakan semalaman.

Proses Percobaan

1. Ambil 150 – 200 ml (tidak lebih dari 300 ml) larutan bakteri yang dikultur semalaman dan sentrifugasi pada suhusekitar 11.000 rpm (12.000 × g) selama 1 – 2 menit.Buang supernatan dan kumpulkan bakteri.

Δ Apabila mengumpulkan lebih dari 50 ml larutan bakteri, bakteri dapat dikumpulkan dengan menambahkan larutan bakteri, sentrifugasi, membuang supernatan dan langkah lainnya dalam tabung 50 ml yang sama untuk

beberapa kali.

2. Tambahkan 7,5 ml Buffer P1 (silakan periksa apakah RNaseA telah ditambahkan ke Buffer P1) ke dalam centrifugetabung yang berisi bakteri dan aduk rata dengan pusaran atau pemipaan.

Δ Resuspensi bakteri secara menyeluruh pada langkah ini sangat penting untuk menghasilkan hasil, dan tidak boleh ada gumpalan bakteri setelah resuspensi.Apabila terdapat gumpalan bakteri yang tidak tercampur sempurna maka akan mempengaruhi proses lisis sehingga menghasilkan rendemen dan kemurnian yang rendah.Jika OD600 larutan bakteri adalah 0,65, disarankan agar 7,5 ml Buffer P1 digunakan saat mengekstraksi dari 150 ml larutan bakteri;ketika OD600 adalah 0,75, 8 ml Buffer P1 harus digunakan dan volume Buffer P2 dan P4 harus diubah.Jika volume larutan bakteri ditingkatkan menjadi 200 ml, dianjurkan agarvolume Buffer P1, P2, dan P4 ditingkatkan secara proporsional.

3. Tambahkan 7,5 ml Buffer P2 ke dalam suspensi bakteri dari langkah 2 dan aduk perlahan ke atas dan ke bawah selama 6 – 8kali dan inkubasi pada suhu kamar selama 4 – 5 menit.

Δ Balikkan perlahan agar tercampur rata.Vortexing akan menyebabkan fragmentasi DNA genom, sehingga menghasilkan fragmen DNA genom pada plasmid yang diekstraksi.Pada saat ini, larutan menjadi kental dan bening, menunjukkan bahwa bakteri telah sepenuhnya lisis.Durasinya tidak boleh lebih dari 5 menit untuk menghindari kerusakan plasmid.Jika solusinya tidak jelas, mungkin terdapat terlalu banyak bakteri yang dihasilkanlisis yang tidak sempurna, sehingga jumlah bakteri harus dikurangi dengan tepat.

4. Tambahkan 7,5 ml Buffer P4 ke dalam suspensi bakteri dari langkah 3 dan segera balikkan perlahan 6 – 8 kali agar larutan menetralkan Buffer P2 sepenuhnya.Pada saat ini, endapan flokulan putih akan muncul.Sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 11.000 rpm (12.000 × g) selama 10 – 15 menit, masukkan supernatan dengan hati-hati ke dalam tabung centrifuge alas bulat 50 ml yang baru (disiapkan sendiri), dan hindarimenyedot endapan putih yang mengambang.

Δ Tambahkan Buffer P4 dan segera balikkan agar tercampur rata.Diamkan tabung sampai endapan putih tersebar merata ke seluruh larutan untuk mencegah terbentuknya endapan lokal yang dapat mempengaruhi netralisasi.Jika tidak ada endapan flokulan putih yang seragam sebelum sentrifugasi dan supernatan tidak jernih setelah sentrifugasi, tabung dapatdisentrifugasi lagi selama 5 menit.

5. Tambahkan 0,1 kali volume (10% volume supernatan, sekitar 2,2 ml) Pemulung Endotoksin ke supernatan dari langkah 4 dan balikkan hingga tercampur.Tempatkan larutan dalam penangas es atau masukkan ke dalam es serut (atau lemari es freezer) selama 5 menit hingga larutan berubah dari keruh menjadi bening dan transparan (atau masihsedikit keruh), dan sesekali aduk beberapa kali.

Δ Setelah Endotoxin Scavenger ditambahkan ke supernatan, supernatan akan menjadi keruh tetapisupernatan akan menjadi jernih (atau sedikit keruh) setelah didinginkan dalam penangas es.

6. Setelah supernatan ditempatkan pada suhu kamar (>25℃) selama 10 – 15 menit, supernatan akan menjadi keruh karenasuhunya meningkat menjadi suhu kamar.Kemudian supernatan harus dibalik agar tercampur.

Δ Jika suhu ruangan lebih rendah atau ingin mempersingkat waktu ekstraksi, supernatan dapat diinkubasi dalam penangas air 37 ~ 42 ℃ selama 5 – 10 menit dan langkah selanjutnya dapat dilakukan setelah supernatanmenjadi keruh.

7. Sentrifugasi supernatan dengan kecepatan sekitar 11.000 rpm (12.000 × g) selama 10 menit pada suhu kamar (suhu harus >25℃) untuk memisahkan fase.Fase air bagian atas mengandung DNA sedangkan lapisan fase berminyak biru bagian bawah mengandung endotoksin dan pengotor lainnya.Pindahkanfase air yang mengandung DNA ke tabung baru danbuang lapisan berminyaknya.

Δ Suhu selama sentrifugasi harus lebih dari 25℃ karena pemisahan fasa efektif tidakterjadi jika suhu terlalu rendah.

Δ Jika pemisahan fasa tidak efektif, suhu sentrifugasi dapat diatur hingga 30℃ danwaktu sentrifugasi dapat ditingkatkan menjadi 15 menit.

Δ Jangan menyedot lapisan berminyak berwarna biru karena mengandung endotoksin dan kotoran lainnya.

Mekanisme

Netralisasi Lisis Resuspensi

◇ Tambahkan 7,5 ml Buffer P1

◇ Tambahkan 7,5 ml Buffer P2

◇ Tambahkan 7,5 ml Buffer P4

Penghapusan endotoksin

◇Tambahkan 0,1 kali volume supernatan Pemulung Endotoksin

Mengikat dan Mencuci

◇ Tambahkan 0,5 kali volume isopropanol

◇ Tambahkan 10 ml Buffer PW