Kit Mini Ekstraksi DNA

Kondisi penyimpanan

Simpan pada -15 ~ -25℃ dan transportasi pada suhu kamar.

Komponen

PDB penyangga:Buffer pengikat DNA.

Penyangga GW:Pencucian buffer;tambahkan etanol absolut sesuai volume yang tertera pada botol sebelum digunakan.

Penyangga Elusi:Elusi.

Kolom Mini DNA FastPure-G:kolom adsorpsi DNA.

Tabung Pengumpul 2 ml:Tabung pengumpul untuk filtrat.

Bahan yang Disiapkan

1,5 ml tabung steril, etanol absolut dan isopropanol (bila fragmen DNA ≤100 bp, tambahkan 1 volume

isopropanol menjadi 1 volume gel), penangas air.

Proses Percobaan

Tambahkan 80 ml etanol untuk mengencerkan Buffer GW sesuai petunjuk pada label sebelum digunakan, simpan pada suhu kamar.

Mekanisme

1. Solusi reaksi PCR

Skema ekstraksi gel: Tambahkan volume yang sama Skema pemulihan solusi reaksi Buffer GDP PCR:Tambahkan 5 kali volume Buffer

2. PDB Hitung volume gel (100  μaku sama dengan 100mg)

Larutkan gelnya

3. Panaskan terlebih dahulu pada 50 ~ 55℃

4. Mengikat Cuci

Tambahkan 300 μL Buffer GDP*

Tambahkan 700 μL Buffer GW

Tambahkan 700 μL Buffer GW

5. mengelusi

Tambahkan 20 – 30μL Elution Buffer atau air deionisasi

Catatan* Pemulihan cairan reaksi PCR tanpa langkah ini

Program ekstraksi gel

1. Setelah elektroforesis DNA untuk fraksionasi fragmen DNA, potong satu strip fragmen DNA dari gel agarosa di bawah sinar UV.Disarankan untuk menggunakan kertas penyerap untuk menyerap kelembapan gel dan meminimalkan ukuran potongan gel dengan menghilangkan agarosa ekstra sebanyak mungkin.Timbang potongan gel (tanpa tabung mikrosentrifugasi) untuk menghitung volumenya: Volume potongan gel 100 mg kira-kira 100 μL, dengan asumsi kepadatannya adalah 1g/ml.

2. Tambahkan Buffer GDP dengan volume yang sama, inkubasi pada suhu 50~55℃ selama 7-10 menit (sesuai ukuran gel, sesuaikan waktu inkubasi hingga gel larut seluruhnya).Balikkan tabung sebanyak 2 kali selama inkubasi.

Δ Penambahan 1-3 volume Buffer GDP tidak akan mempengaruhi efisiensi pemulihan DNA.Jika fragmen DNA yang ingin dipulihkan <100 bp, perlu ditambahkan 3 volume Buffer GDP;ketika irisan gel sudah larut sempurna, tambahkan 1 volume isopropanol dan aduk rata, lalu lanjutkan ke langkah berikutnya.

3. Centrifuge sebentar hingga sampel sampai ke dasar tabung, masukkan FastPure DNA Mini Columns-G ke dalam Tabung Pengumpul 2 ml, pindahkan larutan secara hati-hati maksimal 700 μL satu kali.

waktu ke kolom filtrasi, sentrifugasi pada 12.000 rpm (13.800 X g) selama 30-60 detik.

4. Buang filtratnya dan tambahkan 300 μL Buffer GDP ke dalam kolom, inkubasi pada suhu kamar selama 1 menit, sentrifugasi pada 12.000 rpm (13.800 X g) selama 30-60 detik.

5. Buang filtratnya dan tambahkan 700 μL Buffer GW (periksa apakah etanol absolut telah ditambahkan terlebih dahulu!) ke dalam kolom, sentrifus pada 12.000 rpm (13.800 X g) selama 30-60 detik.

Δ Silakan tambahkan Buffer GW di sekeliling dinding kolom adsorpsi, atau tambahkan penutup belakang Buffer GW dan aduk secara terbalik sebanyak 2 – 3 kali untuk membantu membilas garam yang menempel pada dinding tabung hingga tuntas.

6. Ulangi langkah 5.

Δ Pembilasan dengan Buffer GW dua kali dapat memastikan bahwa garam benar-benar hilang dan menghilangkan dampak pada percobaan berikutnya.

7. Buang filtratnya dan sentrifugasi kolom kosong pada 12.000 rpm (13.800 X g) selama 2 menit.

8. Masukkan kolom ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml yang bersih, tambahkan 20 - 30 μL Elution Buffer ke tengah membran kolom, inkubasi selama 2 menit, lalu sentrifugasi pada 12.000 rpm (13.800 X g) selama 1 menit.Buang kolomnya, simpan DNA yang diperoleh pada -20 .

Δ Memindahkan supernatan dari langkah 8 ke kolom untuk dielusi lagi dan memanaskan Elution Buffer hingga 55 (bila fragmen DNA >3 kb) mungkin membantu meningkatkan efisiensi pemulihan.

Program pemulihan produk PCR

Protokol ini berlaku untuk memurnikan fragmen DNA dari produk PCR, sistem reaksi enzimatik, dan produk kasar DNA lainnya (termasuk DNA genetik).Larutan ini secara efisien dapat menghilangkan berbagai nukleotida, primer, dimer primer, molekul garam, enzim, dan kotoran lainnya.

1. Centrifuge sebentar produk PCR, larutan reaksi enzimatik, dan produk mentah DNA lainnya.Perkirakan volumenya dengan pipet dan pindahkan ke tabung steril 1,5 ml atau 2 ml.Tambahkan ddH2O hingga volumenya mencapai 100 μL;sedangkan untuk DNA genom dengan konsentrasi tinggi, mengencerkan hingga 300 μL dengan ddH2O akan membantu meningkatkan efisiensi pemulihan.

2. Tambahkan 5 volume Buffer GDP, aduk rata dengan cara dibolak-balik atau divorteks.Jika fragmen DNA yang diinginkan >100 bp, tambahan 1,5 volume (sampel + Buffer GDP) etanol perlu ditambahkan.

3. Masukkan kembali kolom ke dalam tabung pengumpul, pindahkan campuran ke dalam kolom, sentrifugasi pada 12.000 rpm (13.800 ×g) selama 30 – 60 detik.Jika volume larutan campuran >700 µL, masukkan kembali kolom adsorpsi ke dalam tabung pengumpul, pindahkan sisa larutan ke kolom adsorpsi, dan sentrifugasi pada 12.000 rpm (13.800 × g) selama 30 – 60 detik.

4. Kinerja selanjutnya mengacu pada langkah 5 – 8 dari program ekstraksi 08-1/Gel.