Transkriptase Terbalik RTL
Transkriptase balik RTL adalah DNA polimerase yang bergantung pada templat RNA yang tidak memiliki aktivitas eksonuklease 3'→5' dan memiliki aktivitas RNase H.Enzim ini dapat menggunakan RNA sebagai cetakan untuk mensintesis untai DNA komplementer, yang dapat diterapkan pada sintesis cDNA untai pertama, terutama untuk RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification).Dibandingkan dengan RTL reverse transkriptase 1.0, sensitivitasnya meningkat secara signifikan, stabilitas termal lebih kuat, dan reaksi pada 65°C lebih stabil.Transkriptase balik RTL (bebas gliserol) dapat digunakan untuk menyiapkan sediaan terliofilisasi, reagen RT-LAMP terliofilisasi, dll.
Definisi Satuan
Satu unit menggabungkan 1 nmol dTTP ke dalam bahan yang dapat diendapkan asam dalam 20 menit pada suhu 50°C menggunakan poli(A)•oligo(dT)25 sebagai primer cetakan.
Komponen
| Komponen | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (Bebas Gliserol) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| Penyangga RTL 10×HC | 1,5 ml | 4×1,5 mL | 5×10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 ml | 2×1,5 mL | 3×10 mL |
Kondisi penyimpanan
Transportasi di bawah 0°C dan disimpan pada -25°C~-15°C.
Kontrol kualitas
- Aktivitas Sisa dariEndonuklease:Reaksi 50 μL yang mengandung 1 μg λDNA dan 15 unit RTL2.0 yang diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 ℃ menunjukkan pola yang sama seperti kontrol negatif dengan elektroforesis gel.
- Aktivitas Sisa dariEksonuklease:Reaksi 50 μL yang mengandung 1 μg Hind Ⅲ yang dicerna λDNA dan 15 unit RTL2.0 yang diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 ℃ menunjukkan pola yang sama seperti kontrol negatif dengan elektroforesis gel.
- Aktivitas Sisa dariNickase:Reaksi 50 μL yang mengandung 1 μg pBR322 superkoil dan 15 unit RTL2.0 yang diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37°C menunjukkan pola yang sama seperti kontrol negatif dengan elektroforesis gel.
- Aktivitas Sisa dariRNase:Reaksi 10 μL yang mengandung 0,48 μg MS2 RNA dan 15 unit RTL2.0 yang diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37°C menunjukkan pola yang sama seperti kontrol negatif dengan elektroforesis gel.
- E.coli gDNA:Diukur denganE.colikit deteksi HCD tertentu, 15 unit RTL2.0 berisi kurang dari 1E.coligenom.
Pengaturan Reaksi
Protokol Sintesis cDNA
| Komponen | Volume |
| Templat RNA a | opsional |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) atau campuran Primer Acak (60uM) | 2 μL |
| Campuran dNTP (masing-masing 10mM) | 1 μL |
| Penghambat RNase (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| Penyangga RTL 10×HC | 2 μL |
| Air Bebas Nuklir | Hingga 20 μL |
Catatan:
1) Dosis Total RNA yang dianjurkan adalah 1ng~1μg
2) Dosis mRNA yang dianjurkan adalah 50ng~100ng
Termo-bersepeda Kondisi untuk rutinitas reaksi:
| Suhu (°C) | Waktu |
| 25 °Ca | 5 menit |
| 55 °C | 10 menitb |
| 80 °C | 10 menit |
Catatan:
1) Jika menggunakan Random Primer Mix, langkah inkubasi pada suhu 25°C.
2) Jika campuran primer target digunakan, langkah inkubasi pada suhu 55°C selama 10~30 menit.
Protokol RT-LAMP
| Komponen | Volume | Konsentrasi Akhir |
| Templat RNA | opsional | ≥10 eksemplar |
| Campuran dNTP (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mm |
| Primer FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Primer F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Primer LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Penghambat RNase (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaksi |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/Reaksi |
| Polimerase DNA Bst V2 (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaksi |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| Buffer 10×HC RTL (atau Buffer 10×HC Bst V2) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Air Bebas Nuklir | Hingga 25 μL | - |
Catatan:
1) Campur dengan cara divorteks dan disentrifugasi sebentar hingga terkumpul.Inkubasi suhu konstan pada 65°C selama 1 jam.
2) Kedua buffer tersebut dapat dioperasikan dan memiliki komposisi yang sama.
Catatan
1. Produk ini akan membentuk padatan putih jika disimpan pada suhu -20 °C.Keluarkan dari suhu -20°C dan masukkan ke dalam es selama sekitar 10 menit.Setelah meleleh, dapat digunakan dengan cara dikocok dan dicampur.
2.Produk cDNA dapat disimpan pada suhu -20°C atau -80°C atau segera digunakan untuk reaksi PCR.
3.Untuk mencegah kontaminasi RNase, harap jaga kebersihan area percobaan, dan kenakan sarung tangan dan masker bersih selama pengoperasian.
