Proteinase K NGS (bubuk)
Nomor Kucing: HC4507A
NGS Protease K adalah protease serin stabil dengan aktivitas enzim tinggi dan spesifisitas substrat yang luas. Enzim ini secara istimewa menguraikan ikatan ester dan ikatan peptida yang berdekatan dengan terminal C asam amino hidrofobik, asam amino yang mengandung sulfur, dan asam amino aromatik.Jadi, sering digunakan untuk mendegradasi protein menjadi peptida pendek.NGS Protease K adalah protease serin khas dengan Asp39-Miliknya69-Ser224triad katalitik yang unik untuk protease serin, dan pusat katalitik dikelilingi oleh dua Ca2+situs pengikatan untuk stabilisasi, mempertahankan aktivitas enzim yang tinggi dalam kondisi yang lebih luas.
Spesifikasi
| Penampilan | Bubuk amorf berwarna putih sampai putih pucat, terliofilisasi |
| Aktivitas tertentu | ≥40U/mg padat |
| DNase | Tidak ada yang terdeteksi |
| RNase | Tidak ada yang terdeteksi |
| beban biologis | ≤50CFU/g padat |
| Residu asam nukleat | <5pg/mg padat |
Properti
| Sumber | Album Tritirachium |
| nomor EC | 3.4.21.64(Rekombinan dari album Tritirachium) |
| Berat molekul | 29kDa (SDS-HALAMAN) |
| Titik isoelektrik | 7.81 Gambar.1 |
| pH optimal | 7.0-12.0 (Semua melakukan aktivitas tinggi) Gambar.2 |
| Suhu optimal | 65℃ Gambar.3 |
| Stabilitas pH | pH 4,5-12,5 (25℃,16 jam) Gambar.4 |
| Stabilitas termal | Di bawah 50℃ (pH 8,0, 30 menit) Gbr.5 |
| Stabilitas penyimpanan | Disimpan pada suhu 25℃ selama 12 bulan Gbr.6 |
| Aktivator | SDS, urea |
| Inhibitor | Diisopropil fluorofosfat;benzilsulfonil fluorida |
Kondisi penyimpanan
Simpan bubuk lyophilized pada -25~-15 ℃ untuk waktu yang lama jauh dari cahaya;Setelah pembubaran, alikuot ke dalam volume yang sesuai untuk penyimpanan jangka pendek pada suhu 2-8℃ dari cahaya atau penyimpanan jangka panjang pada -25~-15 ℃ dari cahaya.
Tindakan pencegahan
Kenakan sarung tangan dan kacamata pelindung saat menggunakan atau menimbang, dan jaga ventilasi yang baik setelah digunakan.Produk ini dapat menyebabkan reaksi alergi kulit dan iritasi mata yang serius.Jika terhirup, dapat menyebabkan gejala alergi atau asma atau sesak napas.Dapat menyebabkan iritasi pernafasan.
Definisi satuan
Satu unit NGS Protease K didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghidrolisis kasein menjadi 1 mol L-tirosin dalam kondisi penentuan standar.
Persiapan reagen
| Reagen | Pabrikan | Katalog |
| teknis kaseindari susu sapi | Sigma Aldrich | Bab 7078 |
| NaOH | Sinopharm KimiaReagen Co., Ltd. | 10019762 |
| Tidak2PO4·2 jam2O | Sinopharm KimiaReagen Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm KimiaReagen Co., Ltd. | 20040618 |
| Asam trikloroasetat | Sinopharm KimiaReagen Co., Ltd. | 80132618 |
| Natrium asetat | Sinopharm KimiaReagen Co., Ltd. | 10018818 |
| Asam asetat | Sinopharm KimiaReagen Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm KimiaReagen Co., Ltd. | 10011018 |
| Sodium karbonat | Sinopharm KimiaReagen Co., Ltd. | 10019260 |
| Foline-fenol | Bioteknologi Sangon (Shanghai)Co, Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirosin | Sigma | 93829 |
Reagen I:
Substrat: 1% Kasein dari larutan susu sapi: larutkan 1g kasein susu sapi dalam 50ml larutan natrium fosfat 0,1M, pH 8,0, panaskan dalam penangas air pada suhu 65-70 °C selama 15 menit, aduk dan larutkan, dinginkan dengan air, disesuaikan dengan natrium hidroksida hingga pH 8,0, dan encerkan hingga 100ml.
Reagen II:
Larutan TCA: asam trikloroasetat 0,1M, natrium asetat 0,2M, dan asam asetat 0,3M (timbang 1,64g asam trikloroasetat + 1,64g natrium asetat + 1,724mL asam asetat berturut-turut, tambahkan 50mL air deionisasi, sesuaikan dengan HCl hingga pH 4,03, dan encerkan ke dalam 100ml).
Reagen III:
Larutan natrium karbonat 0,4m (timbang 4,24g natrium karbonat anhidrat dan larutkan dalam 100mL air)
Reagen IV:
Reagen folin fenol: encerkan 5 kali dengan air deionisasi.
Reagen V:
Pengencer enzim: larutan natrium fosfat 0,1 M, pH 8,0.
Reagen VI:
Larutan standar L-tirosin:0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirosin dilarutkan dengan HCl 0,2M.
Prosedur
1. Nyalakan spektrofotometer UV-Vis dan pilih pengukuran fotometri.
2. Atur panjang gelombang sebagai 660nm.
3. Nyalakan penangas air, atur suhu ke 37℃, pastikan suhu tidak berubah selama 3-5 menit.
4. Panaskan terlebih dahulu 0,5mL substrat dalam tabung centrifuge 2mL pada penangas air 37℃ selama 10 menit.
5. Ekstrak 0,5mL larutan enzim encer ke dalam tabung centrifuge yang telah dipanaskan selama 10 menit.Tetapkan pengencer enzim sebagai kelompok kosong.
6. Tambahkan 1,0 mL reagen TCA segera setelah reaksi.Aduk rata dan inkubasi dalam penangas air selama 30 menit.
7. Larutan reaksi sentrifugasi.
8. Tambahkan komponen berikut sesuai urutan yang ditentukan.
| Reagen | Volume |
| Supernatan | 0,5 ml |
| 0,4M Natrium karbonat | 2,5 ml |
| Reagen folin fenol | 0,5 ml |
9. Aduk rata sebelum diinkubasi dalam penangas air bersuhu 37℃ selama 30 menit.
10. OD660ditentukan sebagai OD1;kelompok kontrol kosong: Pengencer enzim digunakan untuk menggantikan larutan enzim untuk menentukan OD660sebagai OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Kurva standar L-tirosin: 0,5mL larutan L-tirosin dengan konsentrasi berbeda, 2,5mL 0,4M Natrium karbonat, 0,5mL reagen folin fenol dalam tabung sentrifugasi 5mL, inkubasi dalam 37℃ selama 30 menit, deteksi OD660untuk konsentrasi L-tirosin yang berbeda, maka diperoleh kurva standar Y=kX+b, dimana Y adalah konsentrasi L-tirosin, X adalah OD600.
Perhitungan
2: Total volume larutan reaksi (mL)
0,5: Volume larutan enzim (mL)
0,5: Volume cairan reaksi yang digunakan dalam penentuan kromogenik (mL)
10: Waktu reaksi (menit)
Df: Pengenceran berganda
C: Konsentrasi enzim (mg/mL)
Angka
Gambar.1 Residu DNA
| Sampel | jalan C4 | Asam nukleat Pemulihan (hal/mg) | Pemulihan(%) | Nuklir Total Asam ( hal/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| PMS2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O Bebas RNA | Yg tak dpt ditentukan | — | — | — |
Gambar.2 PH optimal
Gambar.3 Suhu optimal
Gambar.4 Stabilitas pH
Gambar.5 Stabilitas termal
Gbr.6 Stabilitas penyimpanan pada 25℃
