Enzim Pembatas Virus Vaccinia

Enzim capping virus Vaccinia berasal dari strain E. coli rekombinan yang membawa gen enzim capping Vaccinia.Enzim tunggal ini terdiri dari dua subunit (D1 dan D12) dan memiliki tiga aktivitas enzimatik (RNA triphosphatase dan guanylyltransferase oleh subunit D1 dan guanine methyltransferase oleh subunit D12).Enzim Capping virus Vaccinia efektif mengkatalisis pembentukan struktur tutup, yang secara spesifik dapat menempelkan struktur tutup 7-metilguanilat (m7Gppp, Cap 0) pada ujung 5′ RNA.Struktur topi (Cap 0) memainkan peran penting dalam stabilisasi mRNA, transportasi dan translasi pada eukariota.Membatasi RNA dengan reaksi enzimatik adalah metode yang efektif dan sederhana yang secara signifikan dapat meningkatkan stabilitas dan translasi RNA untuk transkripsi in vitro, transfeksi, dan injeksi mikro.

Komponen

Enzim Pembatas Virus Vaccinia (10 U/μL)

10×Pembatas Penyangga

Kondisi penyimpanan

-25～- 15℃ untuk penyimpanan （ Hindari siklus pembekuan-pencairan berulang）

Penyangga penyimpanan

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton X- 100, 50% gliserol.

Definisi Satuan

Satu unit Enzim Capping virus Vaccinia didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk memasukkan 10pmol GTP ke dalam transkrip 80nt dalam 1 jam pada suhu 37°C.

Kontrol kualitas

Eksonuklease:10U Enzim Capping virus Vaccinia dengan 1μg λ-Hind III mencerna DNA pada 37 ℃ selama 16 jam tidak menghasilkan degradasi sebagaimana ditentukan oleh elektroforesis gel agarosa.

Endonuklease:10U Enzim Capping virus Vaccinia dengan 1μg λDNA pada 37℃ selama 16 jam tidak menghasilkan degradasi sebagaimana ditentukan oleh elektroforesis gel agarosa.

nama panggilan:10U Enzim Capping virus Vaccinia dengan 1 μg pBR322 pada 37 ℃ selama 16 jam tidak menghasilkan degradasi sebagaimana ditentukan oleh elektroforesis gel agarosa.

RNAse:10U Enzim Capping virus Vaccinia dengan 1,6μg MS2 RNA selama 4 jam pada suhu 37℃ tidak menghasilkan degradasi sebagaimana ditentukan oleh elektroforesis gel agarosa.

1.DNA E.coli:Enzim Capping virus Vaccinia 10U disaring untuk mengetahui keberadaan DNA genom E. coli menggunakan TaqMan qPCR dengan primer spesifik untuk lokus E. coli 16S rRNA.Kontaminasi DNA genom E. coli adalah≤1 genom E. coli.

2.Bakteri Endotoksin: Uji LAL, menurut Chinese Pharmacopoeia IV edisi 2020, metode uji batas gel, aturan umum (1143).Kandungan endotoksin bakteri harus ≤10 EU/mg.

Sistem dan kondisi reaksi

1. Protokol Pembatasan (volume reaksi: 20 μL)

Prosedur ini berlaku untuk reaksi pembatasan 10μg RNA (≥100 nt) dan dapat ditingkatkan sesuai dengan tuntutan eksperimental.

I) Gabungkan 10μg RNA dan H2O bebas nuklease dalam tabung mikrofuge 1,5 ml hingga volume akhir 15,0 μL.*10×Capping Buffer: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8,0)

2) Panaskan pada suhu 65℃ selama 5 menit dilanjutkan dengan penangas es selama 5 menit.

3) Tambahkan komponen berikut dalam urutan yang ditentukan

*10×Capping Buffer：0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) Inkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit, RNA kini tertutup dan siap untuk aplikasi hilir.

2. terminal 5′ reaksi pelabelan (volume reaksi: 20 μL)

Protokol ini dirancang untuk memberi label pada RNA yang mengandung 5´ trifosfat dan dapat ditingkatkan skalanya sesuai permintaan.Efisiensi penggabungan label akan dipengaruhi oleh rasio molar RNA:GTP, serta kandungan GTP dalam sampel RNA.

1) Campurkan RNA dan H2O bebas nuklease dalam jumlah yang sesuai dalam tabung mikrofuge 1,5 ml hingga volume akhir 14,0 µL.

2) Panaskan pada suhu 65℃ selama 5 menit dilanjutkan dengan penangas es selama 5 menit.

3)Tambahkan komponen berikut dalam urutan yang ditentukan.

** GTP MIX mengacu pada GTP dan sejumlah kecil penanda.Untuk konsentrasi GTP, lihatuntuk Catatan 3.

4) Inkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit, ujung RNA 5′ kini diberi label dan siap untuk dihilirkan

Aplikasi

1. Membatasi mRNA sebelum uji translasi/translasi in vitro

2. Memberi label pada ujung 5´ mRNA

Catatan tentang penggunaan

1.Memanaskan larutan RNA sebelum inkubasi dengan Enzim Vaccinia Capping menghilangkan struktur sekunder pada ujung 5´ transkrip.Perpanjang waktu hingga 60 menit untuk transkrip dengan ujung 5 yang sangat terstruktur.

2. RNA yang digunakan untuk reaksi pembatasan harus dimurnikan sebelum digunakan dan disuspensikan dalam air bebas nuklease.EDTA tidak boleh ada dan larutan harus bebas garam.

3. Untuk memberi label pada ujung 5´, konsentrasi GTP total harus sekitar 1-3 kali konsentrasi molar mRNA dalam reaksi.

4. Volume sistem reaksi dapat diperbesar atau diperkecil sesuai dengan keadaan sebenarnya.