PNGase F
Peptida-N-Glikosidase F (PNGase F) adalah metode enzimatik yang paling efektif untuk menghilangkan hampir semua oligosakarida terkait-N dari glikoprotein.PNGase F adalah tengahase, yang membelah antara residu GlcNAc dan asparagin paling dalam dari oligosakarida manosa tinggi, hibrid, dan kompleks dari glikoprotein terkait-N.
Aplikasi
Enzim ini berguna untuk menghilangkan sisa karbohidrat dari protein.
Persiapan dan spesifikasi
| Penampilan | Cairan Tidak Berwarna |
| Kemurnian protein | ≥95% (dari SDS-PAGE) |
| Aktivitas | ≥500.000 U/mL |
| Eksoglikosidase | Tidak ada aktivitas yang dapat terdeteksi (ND) |
| Endoglikosidase F1 | ND |
| Endoglikosidase F2 | ND |
| Endoglikosidase F3 | ND |
| Endoglikosidase H | ND |
| Protease | ND |
Properti
| nomor EC | 3.5.1.52(Rekombinan dari mikroorganisme) |
| Berat molekul | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Titik isoelektrik | 8.14 |
| pH optimal | 7.0-8.0 |
| Suhu optimal | 65 °C |
| Spesifisitas substrat | Memutuskan ikatan glikosidik antara GlcNAc dan residu asparagine Gambar.1 |
| Situs pengakuan | Glikan tertaut-N kecuali mengandung fukosa α1-3 Gambar 2 |
| Aktivator | DTT |
| penghambat | SDS |
| Suhu penyimpanan | -25 ~-15℃ |
| Inaktivasi Panas | Campuran reaksi 20µL yang mengandung 1µL PNGase F diinaktivasi dengan inkubasi pada suhu 75 °C selama 10 menit. |
Gambar 1 Spesifisitas substrat PNGase F
Gambar 2 Tempat Pengakuan PNGase F.
Ketika residu GlcNAc internal dihubungkan dengan fukosa α1-3, PNGase F tidak dapat membelah oligosakarida terkait-N dari glikoprotein.Modifikasi ini umum terjadi pada tumbuhan dan beberapa glikoprotein serangga.
Ckomponen
|
| Komponen | Konsentrasi |
| 1 | PNGase F | 50 ml |
| 2 | 10×Penyangga Denaturasi Glikoprotein | 1000 ml |
| 3 | 10×GlikoBuffer 2 | 1000 ml |
| 4 | 10%NP-40 | 1000 ml |
Definisi satuan
Satu unit (U) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghilangkan >95% karbohidrat dari 10 μg RNase B yang didenaturasi dalam 1 jam pada suhu 37°C dalam total volume reaksi 10 μL.
Kondisi reaksi
1.Larutkan 1-20 µg glikoprotein dengan air deionisasi, tambahkan 1 µl 10×Glikoprotein Denaturing Buffer dan H2O (jika perlu) untuk menghasilkan total volume reaksi 10 µl.
2.Inkubasi pada suhu 100°C selama 10 menit, dinginkan di atas es.
3.Tambahkan 2 μl 10×GlycoBuffer 2, 2 μl 10% NP-40 dan aduk.
4.Tambahkan 1-2 µl PNGase F dan H2O (jika perlu) untuk membuat total volume reaksi 20 μl dan aduk.
5.Inkubasi reaksi pada suhu 37°C selama 60 menit.
6.Untuk analisis SDS-PAGE atau analisis HPLC.
