mRNA Cap2'-O-Metiltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase berasal dari strain E. coli rekombinan yang membawa gen vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase.Enzim ini menambahkan gugus metil pada posisi 2´-O dari nukleotida pertama yang berdekatan dengan struktur tutup di ujung 5´ RNA. Enzim ini menggunakan S-adenosylmethionine (SAM) sebagai donor metil untuk memetilasi RNA yang tertutup (cap -0) menghasilkan struktur cap-1.

Struktur Cap1 dapat meningkatkan efisiensi penerjemahan, meningkatkan ekspresi mRNA dalam percobaan transfeksi dan mikroinjeksi. Enzim ini secara khusus membutuhkan RNA dengan tutup m7GpppN sebagai substrat.Ia tidak dapat memanfaatkan RNA dengan pN, ppN, pppN atau GpppN di ujung 5´.RNA yang dibatasi dapat dibuat melalui transkripsi in vitro menggunakan analog topi atau melalui pembatasan enzimatik menggunakan Enzim Vaccinia Capping.

Komponen

mRNA Cap 2´-O-Metiltransferase (50U/μL)

10×Pembatasan Buffer Reaksi

Penyimpanan

-25 ～- 15℃ untuk penyimpanan （ Hindari siklus beku-cair berulang kali）

Penyangga penyimpanan

20 mM Tris-HCl（pH 8,0,25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X- 100, 50% gliserol.

Definisi satuan

Satu unit didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk memetilasi 10 pmoles transkrip RNA berbatas 80 nt dalam 1 jam pada suhu 37°C.

Tes kendali mutu

Eksonuklease:50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase dengan 1μg λ-Hind III mencerna DNA pada 37 ℃ selama 16 jam tidak menghasilkan degradasi seperti yang ditentukan oleh elektroforesis gel agarosa.

Endonuklease: 50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase dengan 1 μg λDNA pada 37℃ selama 16 jam tidak menghasilkan degradasi sebagaimana ditentukan oleh elektroforesis gel agarosa.

Nickase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase dengan 1μg pBR322 pada 37 ℃ selama 16 jam tidak menghasilkan degradasi sebagaimana ditentukan oleh elektroforesis gel agarosa.

RNase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase dengan 1,6μg MS2 RNA selama 4 jam pada 37℃ tidak menghasilkan degradasi seperti yang ditentukan oleh elektroforesis gel agarosa.

E. E.coli DNA: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase disaring untuk mengetahui keberadaannyaE. E.coli DNA genom menggunakan TaqMan qPCR dengan primer khusus untukE. E.coli Lokus 16S rRNA.ItuE. E.coli kontaminasi DNA genom adalah =1E. E.coli genom.

Bakteri Endotoksin: Uji LAL, menurut Chinese Pharmacopoeia IV edisi 2020, metode uji batas gel, aturan umum (1143).Kandungan endotoksin bakteri harus =10 EU/mg.

Sistem dan kondisi reaksi

1. Gabungkan Capped RNA dan H2O bebas RNase dalam jumlah yang sesuai dalam tabung microfuge 1,5 mL hingga volume akhir 16,0 µL.

2. Panaskan pada suhu 65℃ selama 5 menit diikuti dengan penangas es selama 5 menit.

3. Tambahkan komponen berikut sesuai urutan yang ditentukan (untuk metilasi Capped RNA

kurang dari 10

*10× Buffer Reaksi Pembatasan : 500 mM Tris-HCl(pH 8,0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkubasi pada suhu 37℃ selama 1 jam (disarankan inkubasi 2 jam untuk fragmen target kurang dari 200 nt).

Aplikasi

Untuk meningkatkan ekspresi mRNA selama percobaan mikroinjeksi dan transfeksi.

Catatan tentang penggunaan

1. Sebelum bereaksi, RNA harus dimurnikan dan dilarutkan dalam air bebas nuklease, semua larutan tidak boleh mengandung EDTA dan ion apa pun.

2. Disarankan untuk memanaskan sampel RNA pada 65℃ selama 5 menit sebelum reaksi untuk menghilangkan struktur sekunder pada ujung 5´ transkrip.Ini dapat diperpanjang hingga 10 menit untuk struktur terminal 5 yang kompleks.