Transkriptase Terbalik M-MLV
RevScript Reverse transkriptase diperoleh dengan teknologi rekayasa genetika.Ia memiliki kemampuan sintesis cDNA yang lebih tinggi, stabilitas termal, dan batas suhu reaksi (hingga 60°C).Produk cDNA yang disintesis berukuran hingga 10 kb.Ini meningkatkan afinitas templat dan cocok untuk transkripsi balik templat RNA dengan struktur sekunder kompleks atau gen salinan rendah.
Komponen
| Komponen | HC2003B (10.000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200.000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × Penyangga Skrip Rev | 250 μL | 1,25ml | 5ml |
Kondisi penyimpanan
Produk ini harus disimpan pada suhu -25°C~-15°C selama 2 tahun.
Definisi Satuan
Satu unit menggabungkan 1 nmol dTTP ke dalam bahan yang tidak larut asam dalam 10 menit pada suhu 37°C menggunakan Oligo(dT) sebagai primer.
Pengaturan Reaksi
1.Denaturasi templat RNA (Langkah ini opsional, denaturasi templat RNA membantu membuka struktur sekunder, yang akan meningkatkan hasil cDNA untai pertama.)
| Komponen | Volume (μL) |
| ddH bebas RNase2O | Ke 13 |
| Oligo(dT)18 (50 mol/L) atau Primer Acak (50 mol/L) Atau Primer Spesifik Gen (2 μmol/L) | 1 |
| atau 1 | |
| atau 1 | |
| Templat RNA | X a |
Catatan:
1) a: Total RNA: 1-5 ug atau mRNA: 1-500 ng
2) Inkubasi pada suhu 65°C selama 5 menit, kemudian segera dipindahkan ke dalam es untuk didinginkan selama 2 menit.Sentrifugasi singkat untuk mengumpulkan cairan reaksi, tambahkan larutan reaksi transkripsi terbalik seperti yang ditunjukkan pada tabel berikut.Pipet perlahan agar tercampur.
1.Persiapan campuran reaksi (volume 20 μL)
| Komponen | Volume (μL) |
| Campuran dari langkah sebelumnya | 13 |
| 5×Penyangga | 4 |
| Campuran dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Transkriptase Terbalik (200 U/μL) | 1 |
| Penghambat RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Lakukan reaksi pada kondisi berikut:
| Suhu (°C) | Waktu |
| 25 °Ca | 5 menit |
| 42 °Cb | 15-30 menit |
| 85 °Cc | 5 menit |
Catatan:
1) sebuah.Inkubasi pada suhu 25°C selama 5 menit hanya diperlukan untuk menggunakan heksamer acak.Silakan lewati langkah ini ketika menggunakan Oligo (dT)18atau Primer Spesifik Gen.
2) dgn B.Suhu transkripsi balik yang disarankan adalah 42°C. Untuk templat dengan struktur sekunder yang rumit atau kandungan GC tinggi, disarankan untuk menaikkan suhu reaksi hingga 50-55°C.
3) c.Pemanasan pada suhu 85°C selama 5 menit untuk menonaktifkan transkriptase balik.
4) Produk dapat langsung digunakan dalam reaksi PCR atau qPCR, atau disimpan pada suhu -20°C untuk penyimpanan jangka pendek.Disarankan untuk mencairkan produk dan menyimpannya pada suhu -80°C untuk penyimpanan jangka panjang.Hindari sering membekukan-mencair.
5) Produk ini cocok untuk RT-qPCR satu langkah, disarankan untuk menambahkan 10-20 U transkriptase balik untuk setiap sistem reaksi 25μL, atau secara bertahap meningkatkan jumlah transkriptase balik sesuai dengan situasi aktual.
Catatan
1.Harap jaga kebersihan area percobaan;Sarung tangan dan masker yang bersih harus dipakai selama pengoperasian.Semua bahan habis pakai yang digunakan dalam percobaan harus bebas RNase untuk mencegah kontaminasi RNase.
2.Semua prosedur harus dilakukan di atas es untuk mencegah degradasi RNA.
3.Sampel RNA berkualitas tinggi direkomendasikan untuk memastikan efisiensi transkripsi balik yang tinggi.
4.Produk ini hanya untuk penggunaan penelitian.
5.Harap beroperasi dengan jas lab dan sarung tangan sekali pakai, demi keselamatan Anda.
