M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase adalah transkriptase terbalik yang diperoleh melalui skrining mutasi gen M-MLV asal virus Moloney murine leukemia dan ekspresi pada E.coli.Enzim ini menghilangkan aktivitas RNase H, memiliki toleransi suhu yang lebih tinggi, dan cocok untuk transkripsi balik suhu tinggi.Oleh karena itu, sangat membantu untuk menghilangkan efek buruk dari struktur tingkat tinggi RNA dan faktor non-spesifik pada sintesis cDNA, serta memiliki stabilitas yang lebih tinggi dan kemampuan sintesis transkripsi balik.Enzim ini memiliki stabilitas yang lebih tinggi dan kemampuan sintesis transkripsi balik.
Komponen
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Buffer Untai Pertama (opsional)
* 5 × Buffer Untai Pertama tidak mengandung dNTP, harap tambahkan dNTP saat menyiapkan sistem reaksi
Aplikasi yang Direkomendasikan
1.qRT-PCR satu langkah.
2.Deteksi virus RNA.
Kondisi penyimpanan
-20°C untuk penyimpanan jangka panjang, harus dicampur dengan baik sebelum digunakan, hindari sering dibekukan-dicairkan.
Definisi Satuan
Satu unit menggabungkan 1 nmol dTTP dalam 10 menit pada suhu 37°C menggunakan poli(A)•oligo(dT)25sebagai templat/primer.
Kontrol kualitas
1.Kemurnian elektroforesis SDS-PAGE lebih besar dari 98%.
2.Sensitivitas amplifikasi, kontrol batch-ke-batch, stabilitas.
3.Tidak ada aktivitas nuklease eksogen, tidak ada kontaminasi endonuklease atau eksonuklease eksogen
Pengaturan Reaksi untuk Solusi Reaksi Berantai Pertama
1.Persiapan campuran reaksi
| Komponen | Volume |
| Oligo(dT)12-18 Dasar atau Primer AcakA Atau Primer Spesifik Genb | 50 sore |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 siang | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Templat RNA | Jumlah RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 mcg |
| dH bebas RNase2O | Sampai 10 μL |
Catatan:a/b: Silakan pilih jenis primer yang berbeda sesuai dengan kebutuhan eksperimen Anda.
2.Panaskan pada suhu 65°C selama 5 menit dan dinginkan dengan cepat di atas es selama 2 menit.
3.Tambahkan komponen berikut ke sistem di atas hingga volume total 20µL dan aduk perlahan:
| Komponen | Volume (μL) |
| 5 × Buffer Untai Pertama | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Penghambat RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH bebas RNase2O | Sampai 20 μL |
4. Silakan lakukan reaksi sesuai dengan kondisi berikut:
(1) Jika Primer Acak digunakan, reaksi harus dilakukan pada 25℃ selama 10 menit, dan kemudian pada 50℃ selama 30~60 menit;
(2) Jika Oligo dT atau primer spesifik digunakan, reaksi harus dilakukan pada suhu 50℃ selama 30~60 menit.
5.Panaskan pada suhu 95℃ selama 5 menit untuk menonaktifkan Neoscript Reverse Transcriptase dan menghentikan reaksi.
6.Produk transkripsi terbalik dapat digunakan secara langsung dalam reaksi PCR dan reaksi PCR kuantitatif fluoresensi, atau disimpan pada -20℃ untuk waktu yang lama.
PCR Rreaksi：
1.Persiapan campuran reaksi
| Komponen | Konsentrasi |
| 10 × Buffer PCR (bebas dNTP, gratis Mg²+) | 1× |
| dNTP (10mM setiap dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl22 | 1-4mm |
| Taq DNA Polimerase (5U/μL) | 2-2,5 kamu |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| TemplatA | ≤10% Larutan Reaksi Berantai Pertama (2 μL) |
| ddH2O | Sampai 50 μL |
Catatan:a: Jika terlalu banyak larutan reaksi berantai pertama yang ditambahkan, reaksi PCR dapat terhambat.
2.Prosedur Reaksi PCR
| Melangkah | Suhu | Waktu | Siklus |
| Pra-denaturasi | 95℃ | 2-5 menit | 1 |
| Denaturasi | 95℃ | 10-20 detik | 30-40 |
| anil | 50-60℃ | 10-30 detik | |
| Perpanjangan | 72℃ | 10-60 detik |
Catatan
1.Cocok untuk optimasi suhu transkripsi terbalik di kisaran 42℃~55℃.
2.Ini memiliki stabilitas yang lebih baik, cocok untuk amplifikasi transkripsi balik suhu tinggi.Selain itu, ia menguntungkan untuk melewati daerah struktural RNA yang kompleks secara efisien.Juga, itucocok untuk deteksi RT-PCR kuantitatif fluoresensi multipleks satu langkah.
3.Kompatibilitas yang baik dengan berbagai enzim amplifikasi PCR dan cocok untuk reaksi RT-PCR sensitivitas tinggi.
4.Cocok untuk reaksi RT-PCR kuantitatif fluoresensi satu langkah dengan sensitivitas tinggi, secara efektif meningkatkan tingkat deteksi templat dengan konsentrasi rendah.
5.Cocok untuk konstruksi perpustakaan cDNA.
