KIT ELISA RNA untai ganda (dsRNA).

Kit ini adalah Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) yang digabungkan dengan sistem biotin-Streptavidin, untuk pengukuran kuantitatif dsRNA dengan panjang di atas 60 pasangan basa (bp), apa pun urutannya.Pelat tersebut telah dilapisi sebelumnya dengan antibodi anti-dsRNA.dsRNA yang ada dalam sampel ditambahkan dan berikatan dengan antibodi yang dilapisi pada sumur.Dan kemudian antibodi anti-dsRNA yang terbiotinilasi ditambahkan dan berikatan dengan dsRNA dalam sampel.Setelah dicuci, HRP-Streptavidin ditambahkan dan berikatan dengan antibodi anti-dsRNA yang terbiotinilasi.Setelah inkubasi, HRP-Streptavidin yang tidak terikat hilang.Kemudian ditambahkan larutan substrat TMB dan dikatalisis oleh HRP sehingga menghasilkan produk warna biru yang berubah menjadi kuning setelah ditambahkan larutan penghenti asam.Kepadatan warna kuning sebanding dengan jumlah target dsRNA yang ditangkap di pelat.Absorbansi diukur pada 450 nm.

Aplikasi

Kit ini untuk pengukuran kuantitatif sisa dsRNA.

Komponen perangkat

Penyimpanan dan Stabilitas

1. Untuk kit yang belum terpakai: Seluruh kit dapat disimpan pada suhu 2~8℃ dalam masa simpan.Cahaya yang kuat harus dihindari untuk stabilitas penyimpanan.

2. Untuk perlengkapan bekas: Setelah pelat mikro dibuka, harap tutupi lubang yang tidak terpakai dengan penyegel pelat dan kembalikan ke kantong foil yang berisi kemasan pengering, tutup ritsleting kantong foil dan kembalikan ke suhu 2~8℃ sesegera mungkin setelah digunakan.Reagen lain harus dikembalikan ke 2~8℃ sesegera mungkin setelah digunakan.

Bahan yang Dibutuhkan Tapi Tidak Disediakan

1. Pembaca pelat mikro dengan filter 450±10nm (lebih baik jika dapat mendeteksi pada panjang gelombang 450 dan 650 nm).

2. Pengocok pelat mikro.

3. Tip dan tabung centrifuge bebas RNase.

Diagram Alir Operasi

Sebelum kamu memulai

1. Bawa semua komponen kit dan sampel ke suhu kamar (18-25℃) sebelum digunakan.Jika kit tidak akan habis dalam satu waktu, harap ambil hanya strip dan reagen untuk percobaan ini, dan biarkan sisa strip dan reagen dalam kondisi yang diperlukan.

2. Buffer pencuci: encerkan 40mL buffer pencuci 20× pekat dengan 760mL air deionisasi atau air suling untuk membuat 800mL buffer pencuci 1×.

3. Standar: putar sebentar atau sentrifugasi larutan stok sebelum digunakan.Konsentrasi empat standar yang diberikan adalah 5ng/μL.Untuk standar UTP dan pUTP dsRNA, harap encerkan larutan stok menjadi 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL dengan buffer STE untuk menggambar kurva standar.Untuk standar dsRNA N1-Me-pUTP, harap encerkan larutan stok menjadi 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0pg/μL dengan buffer STE untuk menggambar kurva standar.Untuk standar dsRNA 5-OMe-UTP, harap encerkan larutan stok menjadi 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625,0pg/μL dengan buffer STE untuk menggambar kurva standar.Kami merekomendasikan standar dapat diencerkan sebagai grafik berikut:

4. Antibodi pendeteksi biotinilasi dan larutan kerja HRP-streptavidin: putar sebentar atau sentrifugasi larutan stok sebelum digunakan.Encerkan hingga konsentrasi kerja dengan buffer pengenceran.

5. Substat TMB: sedot larutan sesuai dosis yang diperlukan dengan ujung yang sudah disterilkan dan jangan membuang sisa larutan ke dalam vial lagi.Substat TMB sensitif terhadap cahaya, jangan biarkan substrat TMB terkena cahaya dalam waktu lama.

Menggunakan protokol

1. Tentukan jumlah strip yang diperlukan untuk pengujian.Masukkan strip ke dalam bingkai untuk digunakan.Potongan pelat yang tersisa yang tidak digunakan dalam pengujian ini harus dikemas kembali dalam kantong berisi bahan pengering.Tutup tas dengan rapat untuk penyimpanan berpendingin.

2. Tambahkan 100μL masing-masing pengenceran standar, blanko dan sampel ke dalam sumur yang sesuai.Tutupi dengan sealer pelat.Inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dengan pengocokan pada kecepatan 500rpm.Sampel harus diencerkan dengan buffer STE hingga konsentrasi yang sesuai untuk pengujian yang akurat.

3. Langkah pencucian: Aspirasi larutan dan cuci dengan 250μL buffer pencuci ke setiap sumur dan diamkan selama 30 detik.Buang buffer pencuci seluruhnya dengan menempelkan pelat ke kertas penyerap.Cuci seluruhnya sebanyak 4 kali.

4. Tambahkan 100μL larutan kerja antibodi pendeteksi biotinilasi ke dalam setiap sumur.Tutupi dengan sealer pelat.Inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dengan pengocokan pada kecepatan 500rpm.

5. Ulangi langkah pencucian.

6. Tambahkan 100μL larutan kerja HRP-streptavidin ke dalam setiap sumur.Tutupi dengan sealer pelat.Inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar dengan pengocokan pada kecepatan 500rpm.

7. Ulangi langkah pencucian lagi.

8. Tambahkan 100μL larutan substrat TMB ke dalam setiap sumur.Tutupi dengan sealer pelat.Inkubasi selama 30 menit di RT Lindungi dari cahaya.Cairan akan berubah warna menjadi biru dengan penambahan larutan substrat.

9. Tambahkan 50μL stop solution ke dalam setiap sumur.Cairan akan menguning dengan penambahan larutan penghenti.Kemudian jalankan microplate reader dan segera lakukan pengukuran pada 450nm.

Perhitungan Hasil

1. Rata-rata pembacaan duplikat untuk setiap standar, kontrol, dan sampel, lalu kurangi rata-rata kerapatan optik standar nol.Buatlah kurva standar dengan serapan pada sumbu vertikal (Y) dan konsentrasi dsRNA pada sumbu horizontal (X）.

2. Disarankan untuk melakukan penghitungan dengan perangkat lunak pencocokan kurva berbasis komputer seperti curve expert 1.3 atau ELISA Calc dalam model pencocokan non-linier 5 atau 4 parameter.

Pertunjukan

1. Sensitivitas:

batas bawah deteksi: ≤ 0,001pg/μL (untuk UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01pg/μL (untuk 5-OMe-UTP-dsRNA).

batas bawah kuantitasi: 0,0156 pg/μL (untuk UTP-, pUTP-dsRNA),0,0312 pg/μL (untuk N1-Me-pUTP-dsRNA),0,0625 pg/μL (untuk 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Presisi: CV Intra-Assay ≤10%, CV Inter-Assay ≤10%

3. Pemulihan:80%~120%

4.Linearitas: 0,0156-0,5pg/μL(untukUTP-,pUTP-dsRNA)0,0312-1pg/μL(untukN1-Me-pUTP dsRNA),0,0625-1pg/μL(untuk 5-OMe-UTP-dsRNA).

Pertimbangan

1. Suhu dan waktu reaksi TMB sangat penting, harap kendalikan sesuai dengan instruksi dengan ketat.

2. Untuk mencapai reproduktifitas dan sensitivitas pengujian yang baik, pencucian pelat yang benar untuk menghilangkan kelebihan reagen yang tidak bereaksi sangatlah penting.

3. Semua reagen harus dicampur secara menyeluruh sebelum digunakan dan hindari terjadinya noda selama penambahan sampel atau reagen.

4. Jika kristal telah terbentuk dalam buffer pencuci pekat (20x), hangatkan hingga 37℃ dan aduk perlahan hingga kristal larut sepenuhnya.

5. Hindari pengujian sampel yang mengandung Natrium Azida (NaN3), karena dapat merusak aktivitas HRP sehingga menyebabkan perkiraan jumlah dsRNA terlalu rendah.

6. Hindari kontaminasi RNase selama pengujian.

7. Standar/sampel, antibodi pendeteksi dan SA-HRP juga dapat dilakukan di RT tanpa pengocokan, namun hal ini dapat menyebabkan sensitivitas pendeteksian menurun satu kali lipat.Untuk kasus ini, kami merekomendasikan standar dsRNA UTP dan pUTP harus diencerkan dari 2pg/μL, standar dsRNA N1-Me-pUTP harus diencerkan dari 4pg/μL dan standar dsRNA 5-OMe-UTP harus diencerkan dari 8pg/μL.Selain itu, inkubasi larutan kerja HRP-streptavidin selama 60 menit pada suhu kamar.Jangan gunakan flask shaker, karena flask shaker dapat mengakibatkan hasil yang tidak akurat.

Hasil yang khas

1. Data kurva standar

2. Perhitungan kurva standar

3. Rentang deteksi liner: 0,0312- 1pg/μL